編者按：
??夏日炎炎，又到了空調呼呼吹，跳進(jìn)泳池盡情戲水的季節，我們在享受涼爽的同時(shí)，一種“城市文明病”-軍團病，也悄悄的潛伏在我們身邊。此病到底是什么？引起此病的病原菌應如何檢測？今天，小編就來(lái)跟大家聊一聊。
????何為軍團菌，何為軍團??？
1976年美國費城斯特拉福賓館召開(kāi)退伍軍人大會(huì )，會(huì )后短期內就有數百人發(fā)生細菌性肺炎，共221人發(fā)病，34人死亡。當時(shí)未查明傳染源，按照流行病學(xué)分析，可能是聚會(huì )賓館導致，許多賓館工作人員具有免疫力。后來(lái)，從患者組織中分離出一種革蘭氏陰性桿菌——嗜肺軍團菌，從而發(fā)現了一個(gè)新的細菌家族成員軍團菌屬（Legionella）。此次疾病被命名為軍團?。↙egionnaires’ disease,LD），也稱(chēng)軍團菌?。?em>Legionellosis）。
軍團菌病癥的防治是世界性難題，它的傳播途徑類(lèi)似于新冠病毒，自呼吸道侵入人體后，引起肺炎、胸膜炎、嘔吐、腹瀉、甚至休克和死亡。有報道稱(chēng)軍團菌致死率在5%-10%之前，也就是說(shuō)再不考慮醫療擠兌的情況下，軍團菌的致死率高于新冠，甚至接近非典。并且，此菌更易入侵免疫力低下人群，喜歡“專(zhuān)挑軟柿子捏”。
????軍團菌潛伏在哪里？
軍團菌主要存在天然淡水和長(cháng)時(shí)間不流通的人工水環(huán)境中，隨著(zhù)社會(huì )經(jīng)濟的高速發(fā)展，中央空調、冷卻塔、熱水淋浴器、空氣加濕器等不斷涌入我們的生活，在給生活帶來(lái)便利的同時(shí)，由于管理不善等因素也成為軍團菌散播的工具。尤其疫期間，很多酒店、游泳池都關(guān)門(mén)停業(yè)，場(chǎng)所缺少維護，這就給軍團菌提供了繁殖場(chǎng)所。因此，我國公共場(chǎng)所要求監測嗜肺軍團菌。
軍團菌有哪些特性？
根據伯杰手冊第九版分類(lèi)，軍團菌目（Legionellales），軍團菌科（Legionellaceae)，軍團菌屬(Legionella)。目前發(fā)現的軍團菌屬中有58個(gè)種，3個(gè)亞群，70多種血清型，其中有26種被報道過(guò)引起人類(lèi)感染，而嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)，是引起軍團病的主要病原菌。
???? 軍團菌是革蘭氏陰性桿菌，無(wú)芽孢無(wú)莢膜，有鞭毛能運動(dòng)。專(zhuān)性需氧，普通有氧條件下培養會(huì )生長(cháng)，但若CO2含量為5%，生長(cháng)會(huì )更好。耐酸耐熱，所以對于雜菌較多的樣品，常采用酸處理或熱處理，提高軍團菌檢出率。此外軍團菌最顯著(zhù)的特點(diǎn)是：嗜鐵性和對L-半胱氨酸有絕對的營(yíng)養需求。因此，在含有L-半胱氨酸的BCYE上生長(cháng)而在L-半胱氨酸缺失的BCYE上不生長(cháng)，是初步判斷是否是軍團菌的重要依據。
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?軍團菌如何分離培養?
目前公認的最適宜軍團菌生長(cháng)的培養基是活性炭酵母浸出物培養基（簡(jiǎn)稱(chēng)：CYE）；此培養基基礎里加上鐵，L-半胱氨酸和α-酮戊二酸，成為BCYE培養基（也稱(chēng)BCYEα）；自然樣品和臨床樣本中存在大量雜菌，故在BCYE基礎上添加萬(wàn)古霉素、多粘菌素B和放線(xiàn)菌酮抑制雜菌生長(cháng)，稱(chēng)為GVPC培養基。也有添加其他抗生素（例如：納他霉素或先鋒霉素，成為GCPN或CCCV等），但效果均不如GVPC。（參考 胡朝暉《軍團菌選擇性分離培養基及其實(shí)用性比較研究》）
軍團菌生長(cháng)緩慢，必須保證10天的充分培養，但可以自第2,3,4,5天開(kāi)始檢查GVPC平板。在GVPC上菌落通常白色、灰色、藍色或紫色，也有深褐色、灰綠色、深紅色菌落，表面光滑，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下，部分軍團菌有熒光（杜莫夫軍團菌、博杰曼軍團菌等），但嗜肺軍團菌無(wú)熒光。
怎樣鎖定嗜肺軍團菌？
GVPC分離出軍團菌，BCYE與BCYE-CYS生長(cháng)試驗鎖定軍團菌屬后，如何判斷是否是嗜肺軍團菌呢？國標中嗜肺軍團菌主要四項生化試驗是：硝酸鹽還原（-）、尿素酶（-）、明膠液化（+）、水解馬尿酸（+）。根據表1-軍團菌屬中各種軍團菌生化特征，我們可以看出，馬尿酸水解試驗陽(yáng)性，是嗜肺軍團菌區分于其他軍團菌的重要試驗。馬尿酸陽(yáng)性幾乎就可以鎖定嗜肺軍團菌與菲利軍團菌。而明膠試驗，通常需要培養7~14天，時(shí)效性不好，所以馬尿酸水解試驗，是嗜肺軍團菌判斷的首選試驗。那么問(wèn)題來(lái)了，嗜肺軍團菌的馬尿酸試驗，是使用三氯化鐵法還是茚三酮法？具體的試驗操作如何呢？為何有人做馬尿酸水解試驗陽(yáng)性不明顯呢？這些問(wèn)題國標中都沒(méi)有答案，筆者來(lái)談?wù)勛约旱脑囼灲?jīng)驗。
表1? 軍團菌屬中各軍團菌生化
馬尿酸水解試驗操作要點(diǎn)一：
將0.1g馬尿酸生化鑒定試劑，溶于10mLPBS緩沖液中，制成1%含量的馬尿酸鈉試驗管。用過(guò)濾除菌法除菌后，分裝在1.5mL-2mL無(wú)菌離心管中，備用。注意，馬尿酸鈉試劑不穩定，最好使用近期配制的試劑。
馬尿酸水解試驗操作要點(diǎn)二：
從BCYE平板上刮取大量軍團菌到馬尿酸鈉試驗管中，36℃±1℃水浴培養基4h，注意要水浴培養，培養箱過(guò)夜培養效果不如水浴培養效果好。而后加入0.2mL 3.5%茚三酮溶液，36℃±1℃再水浴10min判斷結果。出現紫色陽(yáng)性，無(wú)顏色變化為陰性。
重要的事情說(shuō)三遍：接種大量軍團菌，水浴培養！接種大量軍團菌，水浴培養！接種大量軍團菌，水浴培養！
明膠實(shí)驗的要點(diǎn)，同樣是接種量要大，而后36℃±1℃培養7-14天，從第7天開(kāi)始觀(guān)察，每天觀(guān)察一次，直至出現液化。
之后血清結果，報告嗜肺軍團菌結果，這里就不再贅述。
小結，軍團菌并不神秘，只是屬于營(yíng)養苛求型細菌，初次分離時(shí)對鐵和L-半胱氨酸有絕對需求，生長(cháng)緩慢，因此在平板上培養時(shí)間為2-7天或7-14天，25℃到43℃均能生長(cháng)，最適生長(cháng)溫度36℃。在普通營(yíng)養瓊脂、血平板和BYCE-CYS（缺少L-半胱氨酸）上均不能生長(cháng)，因此常以BCYE生長(cháng)、BYCE-CYS不生長(cháng)作為軍團菌屬初步確定試驗。由于嗜肺軍團菌是軍團菌屬家族中，為數不多的馬尿酸水解試驗陽(yáng)性菌，因此馬尿酸水解陽(yáng)性就成為篩選的重要依據，用好這把利器就可以輕松鎖定嗜肺軍團菌了。