銅綠假單胞菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，我國礦泉水、包裝飲用水、化妝品等均需要進(jìn)行該菌的檢驗，涉及檢驗標準為GB 8538-2016 《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》、《化妝品安全技術(shù)規范》、GB7918.14-1987《化妝品微生物標準檢驗方法》等。檢驗銅綠假單胞菌我們不得不提熒光假單胞菌，其常作為檢驗過(guò)程中的陰性對照菌株。今天我們就一起來(lái)了解下銅綠假單胞菌以及他的這個(gè)同門(mén)師兄弟—熒光假單胞菌。
顯微鏡下如此相似的菌種，到底有什么不同呢？這些不同又怎么指導我們進(jìn)行日常的微生物檢驗呢？
別急！我們先從菌株活化開(kāi)始。
提到菌株活化，在座的看官們一定認為，So easy! 36℃，TSA，24h，有氧培養！這個(gè)我們經(jīng)常操作，一定沒(méi)問(wèn)題的！可是一上手操作，24h后從36℃培養箱里拿出來(lái)一看，沒(méi)長(cháng)？抑或只長(cháng)了少量菌落？
此時(shí)的您是不是第一想到的是這個(gè)菌一定有問(wèn)題！事實(shí)是什么呢？我們先看看標準的操作方法吧！
嗯，溫度出錯啦！記得30℃以下才能讓我們熒光假單胞菌活化出來(lái)哦！看看比對的結果吧！
熒光假單胞菌活化于TSA平板
菌株已經(jīng)準備就緒，那我們繼續看看熒光假單胞菌與銅綠假單胞菌在培養過(guò)程中的差異。
先從平板開(kāi)始說(shuō)起：
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假單胞菌CN瓊脂：我們可以看到銅綠假單胞菌，36℃培養生長(cháng)良好，為藍綠色菌落；熒光假單胞菌在CN瓊脂上36℃生長(cháng)較弱，25℃生長(cháng)良好，且為淡黃色菌落，置于365nm紫外燈下觀(guān)察熒光反應，熒光假單胞菌熒光明顯。
十六烷三甲基溴化銨瓊脂：銅綠假單胞菌36℃培養，生長(cháng)良好，為黃綠色菌落，而熒光假單胞菌36℃未生長(cháng)，25℃生長(cháng)良好，且為淡黃色菌落。
乙酰胺瓊脂：銅綠假單胞菌生長(cháng)利用乙酰胺產(chǎn)生堿性代謝產(chǎn)物，使得培養基顏色變?yōu)槊导t色，而熒光假單胞菌36℃不生長(cháng)，于25℃培養生長(cháng)良好且未產(chǎn)生堿性物質(zhì)則培養基不變色。
看了上面的結果，您一定想說(shuō)“熒光假單胞菌在36℃不生長(cháng)，沒(méi)有必要用它做為陰性對照了！”其實(shí)也不能斷然下結論，我們接著(zhù)往下看！
將熒光假單胞菌于TSA中，25-30℃培養，得到生長(cháng)良好的純菌落，以用于后續生化鑒定實(shí)驗的陰性對照。
硝酸鹽產(chǎn)氣實(shí)驗《化妝品衛生規范》
硝酸鹽還原試驗是根據某些細菌能還原硝酸鹽。并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣，觀(guān)察硝酸鹽胨水培養基內的小導管中有氣體者，即為陽(yáng)性。銅綠假單胞菌應呈陽(yáng)性，熒光假單胞菌呈陰性。從實(shí)驗結果我們可以看到銅綠假單胞菌出現明顯產(chǎn)氣現象，熒光假單胞菌在28℃和36℃均可正常生長(cháng)，并呈現陰性反應。
? ?明膠液化實(shí)驗
明膠是肽分子聚合物質(zhì)，是膠原蛋白多級的水解產(chǎn)物，溶點(diǎn)在24-28℃之間，即在低于溶點(diǎn)時(shí)明膠處于固體狀態(tài)。部分細菌可以產(chǎn)生胞外酶-明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，變?yōu)榱鲃?dòng)的液體狀態(tài)。操作時(shí)，將新鮮活化的菌株穿刺接種于明膠培養基中，置于相應溫度下培養，培養結束將培養物置于2-8℃冰箱冷藏，30min后進(jìn)行觀(guān)察，若培養物為流動(dòng)狀態(tài)說(shuō)明明膠液化陽(yáng)性，若為凝固狀態(tài)則為陰性。銅綠假單胞菌為陽(yáng)性，熒光假單胞菌為陰性。
明膠液化實(shí)驗
（熒光假單胞菌28℃培養-熒光假單胞菌36℃培養-銅綠假單胞菌）
乙酰胺還原實(shí)驗
乙酰胺肉湯中的主要成分為乙酰胺，微生物代謝分解乙酰胺酶將乙酰胺分解，產(chǎn)生NH4+；鈉氏試劑主要成分為氯化汞（HgCl2）和碘化鉀（KI），化學(xué)反應式如下：
鈉氏試劑：HgCl2+2KI==2KCl+HgI2；
鈉氏試劑與NH4+反應：
我們肉眼看到的紅色的沉淀就是HgO·Hg(NH2)I，這個(gè)反應非?？?，所以觀(guān)察結果時(shí)在培養物中滴加鈉氏試劑后在10s內觀(guān)察結果。銅綠假單胞菌乙酰胺還原反應陽(yáng)性；熒光假單胞菌還原反應陰性。
為了保證結果的準確性，操作過(guò)程中可以挑取菌落接種以加大接菌量，并且培養時(shí)間要充分，以保證得到大量的代謝產(chǎn)物！
乙酰胺肉湯實(shí)驗（滴加鈉氏試劑前）?
空白-熒光假單胞菌28℃培養 –熒光假單胞菌36℃培養 -銅綠假單胞菌
乙酰胺肉湯實(shí)驗（滴加鈉氏試劑后）
綠膿菌素測定實(shí)驗：
綠膿菌素是銅綠假單胞菌代謝產(chǎn)生的胞外次級代謝產(chǎn)物，部分有機溶劑可促進(jìn)綠膿菌素的產(chǎn)生，其可發(fā)生可逆的氧化還原作用，堿性條件時(shí)呈氧化型藍色，酸性條件時(shí)呈還原型紅色。在進(jìn)行綠膿菌素測定時(shí)，若該菌可代謝產(chǎn)生綠膿菌素，向培養物中加入三氯甲烷使得色素溶出，再繼續滴加1mol/L鹽酸，可出現肉眼可見(jiàn)的紅色還原型產(chǎn)物。
銅綠假單胞菌若產(chǎn)生綠膿菌素，培養物為藍綠色，加入氯仿后溶液呈淡藍色，繼續滴加1mol/L鹽酸，溶液表面出現紅色。熒光假單胞菌并不能出現上述反應，為陰性。
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銅綠假單胞菌+氯仿+鹽酸后綠膿菌素測定實(shí)驗
看完生化反應結果，您是否明白了，雖然熒光假單胞菌在部分培養基中36℃生長(cháng)較弱，但是并不影響他參與生化反應的對照作用，在以上生化鑒定過(guò)程中，熒光假單胞菌在36℃生長(cháng)良好，并呈陰性反應。
所以如果您想看到平板上的陰性對照反應，可以把平板置于30℃以下培養，如果是微量生化鑒定反應可以和樣品及陽(yáng)性對照一同放入36℃進(jìn)行培養即可。
（說(shuō)明：本次實(shí)驗圖片中菌株來(lái)源：銅綠假單胞菌 CMCC 10104；熒光假單胞菌 CICC 21612）
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銅綠假單胞菌檢測用培養基列表
參考文獻
金杰人，魯凱，珩肖明 熒光假單胞菌的應用與展望[J].上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）2019 .48（5）：526-535
徐笑洋,邱晨.?銅綠假單胞菌生物膜耐藥的研究進(jìn)展[J].?廣東醫學(xué). 2012(10)
靳磊,范貴生,呂加平.耐熱性脂肪酶及其對UHT乳品質(zhì)的影響[J].?食品研究與開(kāi)發(fā). 2008(04)
常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊[M]. 科學(xué)出版社 , 東秀珠,蔡妙英等編著(zhù), 2001
伯杰細菌鑒定手冊[M]. 科學(xué)出版社 , ()布坎南(R.E.Buchanan)等編, 1984
Murat?Ozda. ?A new strategy for?the?efficient production of?pyocyanin, a?versatile pigment, in?Pseudomonas aeruginosa OG1 via?toluene addition. 3 Biotech, 2019, Vol.9 (10), pp.1-8
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