在我們食品微生物檢測過(guò)程中，除了我們知道要檢測的目標微生物之外，往往會(huì )出現一些和目標微生物表現不一，但你又想知道它是什么菌屬的情況，特別是對于一些生產(chǎn)企業(yè)，有時(shí)候往往會(huì )懷疑是否是因為這個(gè) “非目標菌”的存在，從而影響到了產(chǎn)品質(zhì)量。
那怎么去鑒定那些“非目標”微生物呢？又有哪些方法和手段可以采用呢？
下面就跟隨小王，來(lái)了解下我們食品微生物檢測中常用的一些鑒定手段！
傳統的細菌系統分類(lèi)，也就是常說(shuō)的鑒定，通常是通過(guò)純培養分離后從形態(tài)學(xué)、生理生化反應特征以及免疫學(xué)特性（血清學(xué)分析）進(jìn)行鑒定。這也是我們目前國標中最常用的鑒定手段，這種方法的優(yōu)點(diǎn)就是所用試劑簡(jiǎn)單易得，常規實(shí)驗室即可展開(kāi)，經(jīng)濟實(shí)用，缺點(diǎn)呢，就是鑒定所需時(shí)間較長(cháng)，且容易判斷不準確。
用這種方法，要先進(jìn)行革蘭氏染色，從鏡檢分析其可能的微生物種屬，再根據判斷結果，按照《伯杰氏手冊》上的生化項目進(jìn)行實(shí)驗，最終確定其可能的微生物種屬。比如，鏡檢是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，且周?chē)蚓w頂端有芽孢產(chǎn)生，這時(shí)候我們就要往芽孢桿菌的方向去進(jìn)行生理生化鑒定。
全自動(dòng)微生物鑒定系統，比如我們常見(jiàn)的VITEK、Biolog等，其原理也是依據微生物的生理生化特性，有所區別的就是它采用了大量的微生物種屬去進(jìn)行建庫，利用統計學(xué)的一些手段，對未知的微生物進(jìn)行打分，確定其相關(guān)種屬。通?？设b定包括需氧細菌、厭氧細菌、酵母菌和絲狀真菌在內的2000余種微生物，幾乎涵蓋了微生物學(xué)不同領(lǐng)域中比較重要的菌種，所涉及領(lǐng)域包括制藥、生物技術(shù)、化妝品、獸醫和臨床醫學(xué)、農業(yè)和環(huán)境科學(xué)、食品加工和安全，也可應用于微生物代謝、特性和群落等的分析研究。
飛行時(shí)間質(zhì)譜，也就是我們常叫的飛行質(zhì)譜，其原理是利用基質(zhì)輔助激光解析電離方法得到待測樣品分子離子，通過(guò)測得待測微生物的肽質(zhì)量指紋圈譜（PMF)，并將其與數據庫中的微生物標準指紋圖譜進(jìn)行匹配檢索，從而完成鑒定（可鑒定至種或屬）。該儀器適用于絕大多數的微生物鑒定，可同時(shí)鑒定細菌及真菌，相對于傳統方法，具有更加快速準確、高通量檢測、操作簡(jiǎn)單、成本低（鑒定數量大的情況）的優(yōu)勢。
飛行時(shí)間質(zhì)譜，也就是我們常說(shuō)的飛行質(zhì)譜，其原理是利用基質(zhì)輔助激光解析電離方法得到待測樣品分子離子，通過(guò)測得待測微生物的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF)，并將其與數據庫中的微生物標準指紋圖譜進(jìn)行匹配檢索，從而完成鑒定（可鑒定至種或屬）。該儀器適用于絕大多數的微生物鑒定，可同時(shí)鑒定細菌及真菌，相對于傳統方法，具有更加快速準確、高通量檢測、操作簡(jiǎn)單、成本低（鑒定數量大的情況）的優(yōu)勢。
對于已知鑒定目標的項目，可以采用商業(yè)化的試劑盒來(lái)進(jìn)行操作，不管是普通PCR還是熒光PCR都可以，根據自己的需要采用合適的就可以。因為大多數的目標基因序列都已公開(kāi)，且在一些官方機構或標準文獻中給出了相應的引物序列及探針，因此大家可以放心使用。
而對于一些未知的、你又想知道是什么種屬的微生物，就要采用另外的手段來(lái)進(jìn)行了，比如我們常聽(tīng)說(shuō)的16s rRNA鑒定。
60年代末 , Woese CR開(kāi)始采用寡核苷酸編目法對生物進(jìn)行分類(lèi)，依據16s rRNA序列繪制進(jìn)化樹(shù)，將地球上的細胞生物分為了三個(gè)域，即古生菌、細菌和真核生物。而所謂的16s rRNA就是指核糖體RNA，因為其功能同源且最為古老、既含保守序列又有可變序列、大小最適合做進(jìn)化分析，所以一般細菌鑒定用其作為分析對象。目前各大研究所、院校及疾控等有實(shí)力的實(shí)驗室都有開(kāi)展16s rRNA鑒定未知微生物的實(shí)驗。
具體方法為：提取目標菌的全基因組DNA，使用通用引物對其進(jìn)行擴增，將擴增好的16s rRNA的DNA序列連接到特定的質(zhì)粒載體上進(jìn)行測序，然后以16s rRNA數據庫中的序列進(jìn)行比對，進(jìn)而確認其種屬。
該方法鑒定指標單一明確，就是以16s rRNA為基準，因此準確性高，可鑒定種屬龐大，但也有極個(gè)別不太適用的種屬，比如乳酸菌屬。
看完了這些，相信各位看家應該對微生物鑒定這塊有了一個(gè)大致的了解，后續想知道更詳細的關(guān)于微生物方面的知識，還請繼續關(guān)注北京陸橋！
參考文獻：
R.E.布坎南,N.E.吉本斯等.伯杰細菌鑒定手冊(第八版)[M].北京:科學(xué)出版社,1984.
程池,楊梅,李金霞,等.Biolog微生物自動(dòng)分析系統-細菌鑒定操作規程的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,23(5):50～54
周煜. 16S rRNA序列分析法在醫學(xué)微生物鑒定中的應用[J]. 生物技術(shù)通訊, 1999(04):297-305.