培養基的適用性檢查是確定培養基質(zhì)量及保證實(shí)驗結果正確的前提，因此如何高效完成培養基適用性檢查成為實(shí)驗室關(guān)注的重點(diǎn)。那么，今天我和大家一起梳理、探討無(wú)菌檢查法中培養基適用性檢查的實(shí)驗要點(diǎn)及注意事項。
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無(wú)菌檢查法測試用培養基
中國藥典2020版四部1101無(wú)菌檢查法采用硫乙醇酸鹽流體培養基(FTM）和胰酪大豆胨液體培養基（TSB）作為主要測試培養基，其中TSB替代了2010版的改良馬丁培養基，這兩種培養基在促微生物生長(cháng)能力和微生物生長(cháng)種群的廣泛性上無(wú)顯著(zhù)性差異，但TSB在培養霉菌方面略?xún)?yōu)于改良馬丁培養基，并且TSB的pH值為7.3±0.2，相較于改良馬丁培養基的pH值6.4±0.2，TSB更適宜微生物的生長(cháng)。
藥典明確了FTM和TSB這兩種培養基的適用范圍：硫乙醇酸鹽流體培養基是厭氧菌檢查的首選培養基，同時(shí)也可用于需氧菌檢查；胰酪大豆胨液體培養基適用于真菌和需氧菌檢查。即產(chǎn)品中可能存在的需氧菌無(wú)論被接種到哪種培養基中都能被檢出。
兩種培養基的成分與作用見(jiàn)下圖：
培養基的適用性檢查
1101無(wú)菌檢查法所用培養基適用性檢查包括無(wú)菌性檢查與靈敏度檢查。
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? ? ? ?1、無(wú)菌性檢查
標準規定：每批培養基一般隨機取不少于5支（瓶），放置在每種培養基規定的溫度下培養14天，應無(wú)菌生長(cháng)。
注意：該部分實(shí)驗意義在于證明測試所用培養基的無(wú)菌性，若無(wú)菌檢查測試中有菌檢出，考慮菌來(lái)源于他處。如果培養14天后仍然不能從外觀(guān)上判斷有無(wú)微生物生長(cháng)，可取至少1mL該培養液轉種至同種新鮮的培養基中，再培養4天觀(guān)察結果。
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? ? ? ?2、靈敏度檢查
1）菌種
培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過(guò)5代(從菌種保存中心獲得的干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存和確認，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。
注意：在9203藥品微生物實(shí)驗室質(zhì)量管理指導原則中對于菌種的要求“必要時(shí)，實(shí)驗室應對工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認”，在做確認時(shí)，可以是劃線(xiàn)平板觀(guān)察菌落形態(tài)，也可以做革蘭氏染色、生化鑒定等。
2）培養基接種
取適宜裝量的FTM 7支，分別接種不大于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照；取適宜裝量的TSB 7支，分別接種不大于100CFU的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照。接種細菌的培養管培養時(shí)間不超過(guò)3天，接種真菌的培養管培養時(shí)間不得超過(guò)5天。
注意：該部分實(shí)驗意義在于證明所用培養基的靈敏度足以檢出產(chǎn)品中可能污染的微生物。2020版藥典中對于培養基的裝量沒(méi)有強制要求，可以參照前一版藥典中的裝量要求進(jìn)行配制，即FTM每管裝量為12mL/支，TSB每管裝量為9mL/支。但需要注意，FTM的裝量與容器高度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過(guò)培養基深度的1/2。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過(guò)培養基深度的1/3。
標準要求接種菌量不大于100CFU，測試時(shí)需同步進(jìn)行涂布，對具體加菌量進(jìn)行計數。
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3）結果判定
空白對照管應無(wú)菌生長(cháng)，若加菌的培養基管均生長(cháng)良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。
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? ?? ?4）靈敏度檢查結果（圖示）
其他注意事項
為保證培養基的質(zhì)量，實(shí)驗室對培養基的購買(mǎi)應有計劃，并對培養基進(jìn)行外觀(guān)檢查，指標包括容器密閉性檢查、內容物的感官檢查等。培養基開(kāi)瓶時(shí)應記錄首次開(kāi)封日期，開(kāi)封后的脫水合成培養基，其質(zhì)量取決于貯存條件。通過(guò)觀(guān)察粉末的流動(dòng)性、均勻性、結塊情況和色澤變化等判斷脫水培養基的質(zhì)量的變化。若發(fā)現培養基受潮或物理性狀發(fā)生明顯改變則不應再使用。
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參考資料：
1、中華人民共和國藥典 2020年版 四部
2、GB4789.28-2013 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 培養基和試劑的質(zhì)量要求
3、中國藥典分析檢測技術(shù)指南