克羅諾桿菌的簡(jiǎn)介

克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種革蘭氏陰性的無(wú)芽孢短小桿菌，屬于腸桿菌科，是一種兼性厭氧的條件性致病菌。在顯微鏡下呈球桿狀或成對排列，有時(shí)也可呈短鏈狀，大小為（0.6μm-1.1μm）×（1.2μm-3.0μm），周身鞭毛，有動(dòng)力，廣泛分布于嬰幼兒配方粉、奶粉、奶酪、水果、蔬菜、肉制品以及自然環(huán)境中。

? ? ? ?克羅諾桿菌曾被認為是產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌，1980年法默等通過(guò)不同菌株之間的DNA雜交、生化、血清等特性，將其正式更名為阪崎腸桿菌，2008年又重新將其定義為克羅諾桿菌屬。該菌屬共包括7個(gè)種和3個(gè)亞種，即阪崎克羅諾桿菌、蘇黎世克羅諾桿菌、都柏林克羅諾桿菌（含有3個(gè)亞種：都柏林克羅諾桿菌都柏林亞種、都柏林克羅諾桿菌洛桑亞種、都柏林克羅諾桿菌乳粉亞種）、穆汀斯克克羅諾桿菌、丙二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌、康迪蒙提克羅諾桿菌和尤尼沃斯克羅諾桿菌。模式種為阪崎克羅諾桿菌，模式菌株為ATCC 29544。

克羅諾桿菌的檢驗標準的更新

? ? ? ?在2024年2月8日頒布的GB 4789.40-2024版本中，在適用范圍中增加了嬰幼兒輔助食品，即新標準適用于嬰幼兒配方食品、?嬰幼兒輔助食品、 乳及乳制品及其原料中克羅諾桿菌的檢驗。

（圖片來(lái)源于GB4789.40-2024）

克羅諾桿菌定性檢驗

1.?前增菌和增菌

? ? ? ?取檢樣100 g(mL) 置無(wú)菌容器中, 加入900 mL 已預熱至41℃±1℃?的緩沖蛋白胨水用手緩緩地搖動(dòng)至充分溶解,36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h±2 h。移取1 mL 轉種于10 mL mLST-Vm 肉湯，41.5℃±1℃培養24 h±2 h。

? ? ? ?由于取樣量較大，如用到剪刀勺子等工具，需提前高壓滅菌，也可以使用無(wú)菌的大均質(zhì)袋來(lái)進(jìn)行前增菌，便于節省空間。培養時(shí)，需防止均質(zhì)袋翻倒造成液體溢灑及封口不當發(fā)生污染。

BPW預熱至41℃±1℃有助于粉狀樣品充分溶解，也避免了因液體較多升溫較慢引起的增菌失敗。必要時(shí)，可拍打均質(zhì)袋使粉狀樣品充分溶解混勻，BPW相較于無(wú)菌生理鹽水等能更好地使受損或缺乏營(yíng)養的細菌恢復生長(cháng)。

BPW

? ? ? ? 克羅諾桿菌屬具有較強的耐滲透壓能力和較好的耐熱性，且對萬(wàn)古霉素天然耐藥，因此使用的改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLST-Vm）肉湯在提供了良好營(yíng)養的條件下利用高濃度的氯化鈉和萬(wàn)古霉素，且在41.5℃±1℃培養，能有效的抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和其他不耐滲透壓、不耐熱的細菌生長(cháng)。之前2016版標準中44℃的選擇性增菌溫度，是因為該溫度與ISO 22964-2006相同，但目前國際普遍認為該溫度可能抑制部分受損傷的克羅諾桿菌生長(cháng)，容易導致污染樣品發(fā)生漏檢。?因此ISO 22964-2017已將選擇性增菌溫度由44 ℃±0.5 ℃修改為41.5 ℃±1 ℃，2024版的新標準也進(jìn)行了相應的調整。

mLST-Vm

（圖片來(lái)源于GB4789.28-2024）

2. 分離

輕輕混勻?mLST-Vm 肉湯培養物, 各取增菌培養物1 環(huán), 分別劃線(xiàn)接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養基平板, 36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h±2 h, 或按商品化培養基的要求條件進(jìn)行培養。

顯色培養基

目前北京陸橋有三款適用于克羅諾桿菌檢驗的顯色培養基。由于標準未規定產(chǎn)品配方，客戶(hù)可根據需求任選其一。

• ESM015 克羅諾桿菌顯色培養基（DFI）：樣品干擾菌少時(shí)可選擇。

• ESM016 克羅諾桿菌顯色培養基：對樣品中的干擾菌有更好的選擇性和分辨性。

• ESM020 克羅諾桿菌顯色培養基（CCI）：ISO22964-2017標準中CCI瓊脂。

ATCC 29544阪崎克羅諾桿菌在三種培養基上的生長(cháng)情況

樣品分離干擾菌在三種培養基上的生長(cháng)情況

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?注：CCI在實(shí)際表現中與DFI相近

每個(gè)平板挑取至少5 個(gè)可疑菌落, 不足5個(gè)時(shí)挑取全部可疑菌落, 劃線(xiàn)接種于 TSA 平板。36?℃ ±1 ℃培養24?h±2?h。

有文獻報道和相關(guān)檢測中發(fā)現，部分克羅諾桿菌不產(chǎn)黃色素，因此在新標準中，刪除了黃色素的生化鑒定項目。

3.鑒定

自TSA平板上直接挑取可疑菌落, 進(jìn)行生化鑒定?？肆_諾桿菌屬的主要生化特征見(jiàn)標準中的表3?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統。新標準中，刪除了苦杏仁苷生化項目。

（圖片來(lái)源于GB4789.40-2024）

4. 分子生物學(xué)檢測

隨著(zhù)乳制品生產(chǎn)企業(yè)和相關(guān)監管部門(mén)對檢測方法時(shí)效性和準確性需求的日益迫切，傳統的檢測方法雖然準確可靠，但操作繁瑣、工作量大、耗時(shí)較長(cháng)，已不能滿(mǎn)足快檢的要求。而分子生物學(xué)的檢測方法，由于其具有特異性強、準確性高且快速的優(yōu)勢，近年來(lái)被逐漸引入到食品微生物的檢測標準（例如GB 4789.6-2016）中。SN/T 1632.3-2013出口奶粉中阪崎腸桿菌（克羅諾桿菌屬）檢驗方法中就有關(guān)于克羅諾桿菌熒光PCR的檢測方法。在新的克羅諾桿菌檢測標準中也增加了PCR鑒定的方法，將其作為選做內容。

? ? ? 北京陸橋的MX-1301克羅諾桿菌屬核酸檢測試劑盒，采用熒光PCR的檢測技術(shù)，對克羅諾桿菌屬的特異性基因進(jìn)行檢測，且含有內標基因，只根據其擴增曲線(xiàn)即可進(jìn)行判定，簡(jiǎn)便快捷，可根據需求進(jìn)行菌液或菌落的鑒定，極大的豐富了克羅諾桿菌的鑒定手段。

克羅諾桿菌屬核酸檢測試劑盒及阪崎克羅諾桿菌熒光PCR結果圖

5.結果與報告

綜合菌落形態(tài)、生化鑒定或PCR鑒定結果, 報告每100 g(mL) 樣品中檢出或未檢出克羅諾桿菌屬。

點(diǎn)擊查看：GB 4789.40-2024克羅諾桿菌檢測產(chǎn)品列表